一种广泛应用的扫描探针显微镜

原子力显微镜（AFM）是一种广泛应用的扫描探针显微镜（SPM）技术，能够以纳米分辨率在高度图像中获得绝缘和导电结构样品表面的形貌特征。AFM成像不需要复杂的样品制备，并且可以在空气和液体环境中操作。然而，在生理条件下对柔软的生物样品进行成像时，大多数SPM技术都存在固有的缺点。因此，动态AFM模式使悬臂在接近样品表面的位置振荡，以对成像样品形貌所需的相互作用力敏感。在柔软的样品上，甚至应严格避免AFM针尖与样品之间的间歇性接触，以避免样品变形或损坏。此外，在包括高盐浓度液体环境的生理条件下，用于非接触成像的吸引性探针-样品相互作用力可能会被屏蔽。

在这里，扫描离子电导显微镜（SICM）是一种资源丰富的SPM方法，适用于分子生物学和材料科学研究，因为SICM确保非接触成像，并且在高离子浓度的液体介质中工作良好。SICM的基本操作依赖于在纳米移液管电极和浴池电极之间流动的离子电流。该离子电流用作反馈信号，以维持移液管与样品之间的恒定距离，从而使纳米移液管能够扫描表面以进行形貌成像。重要的是，对离子电流变化的敏感性能够在没有移液管与样品之间任何物理接触的情况下进行测量。这一方面对于成像柔软的生物样品，尤其是活细胞至关重要。

图1. 扫描离子电导显微镜（SICM）实验装置的示意图。（a）充满电解质的纳米移液管被置于接近感兴趣样品的位置。在移液管内的电极和本体溶液中的另一个电极之间施加的偏压产生离子电流，该电流可用于反馈控制。（b）在移液管-样品距离远和近时，离子电流与Z位移的曲线。

SICM由Hansma等人于1989年开发。与其他SPM技术不同，SICM被专门设计用于非侵入性地研究生物系统。SICM的工作原理基于监测电解质溶液中两个电极（一个在纳米移液管内，另一个在电解质中，如图1（a）所示）之间的离子电流变化。通常，SICM使用银/氯化银（Ag/AgCl）电极。在电解质两端施加电压后，浴池电极向移液管电极引入电流信号。随着移液管开口与样品之间距离的减小，离子电流部分受阻，这种受阻现象具有明显的距离依赖性，如图1（b）所示。当纳米移液管在接近样品表面的位置扫描时，反馈控制检测局部电流信号变化，并通过Z扫描器调整移液管-样品距离，以保持恒定的电流信号。从Z扫描器的移动中，我们最终获得样品形貌。对于SICM测量的横向分辨率，纳米移液管的内径是决定性的。通常，纳米移液管的内径约为100纳米，但直径低至30纳米也是可能的。SICM的高电流灵敏度确保了扫描过程中纳米移液管与样品之间没有任何物理接触，并允许记录软生物样品（如活细胞）所需的真正非接触式样品形貌图像。

图2. ARS模式的工作示意图。（a）标准线性接近，（b）用于敏感测量的两步线性接近。回缩：较高的提升高度保证移液管的完整性，但增加了接近时间。接近：接近过程分为两步，首先是快速接近（粗略），然后是慢速接近（精细）。电流设定点：基于远离表面的参考电流，保持恒定的移液管-样品距离。

Park Systems的AFM上SICM有两种操作模式：一种是直流（DC）模式，另一种是接近-回缩扫描（ARS）模式。在DC模式中，当移液管远离样品表面时，移液管读取初始电流值作为参考电流。根据此参考电流，确定Z反馈的设定点电流（例如，参考电流的99%）。随后，纳米移液管接近样品表面，直到达到设定点，然后可以开始SICM测量。在扫描过程中，形貌特征（如表面突起或凹陷）将分别导致局部电流信号减小或增加。这种偏离电流设定点的现象被检测为错误信号，并使用该错误信号，Z扫描器提升或降低纳米移液管，直到重新建立设定点。通过这种方式，在恒定的移液管-样品距离下通过连续扫描获得表面形貌。

然而，在DC模式下对具有几微米高度差的生物样品或细胞的详细特征进行成像可能会导致形貌失真。ARS模式通过在扫描的每个像素上接近和回缩移液管来测量电流信号。每个接近和回缩周期首先确定远离表面的参考电流和电流设定点。随后，移液管接近样品表面，直到电流值达到设定点，并记录Z扫描器的位置。最后，移液管充分远离样品以避免损坏，并移动到下一个成像点。因此，与DC模式相比，ARS-SICM以较低的扫描速率提供了极其稳定的成像条件。对于特别敏感的测量，除了常规线性接近外，ARS还提供了更精准的两步接近技术（图2）。两步接近包括更快的粗略接近和慢速精细接近，以避免移液管或样品损坏。

图3. Park Systems的SICM扫描头，配有适当的纳米移液管定位和所有电气连接。纳米移液管的光学和扫描电子显微镜（SEM）图像。

与AFM使用带有纳米级针尖的悬臂不同，SICM使用纳米移液管作为成像探针（图3）。这些纳米移液管由玻璃毛细管（内径：0.58毫米，外径：1毫米，长度：5~55毫米）或石英毛细管（内径：0.5~50毫米，外径：1.0毫米，长度：5~55毫米）制成，这些毛细管通过移液管拉制器拉制而成。所得纳米移液管的内径由针尖长度、玻璃毛细管的内径、壁厚和拉制器参数决定。通常，SICM成像中使用100纳米内径的纳米移液管。

图4展示了在气管组织纤毛细胞上进行的一项代表性测量，以突出SICM在细胞成像方面的潜力。SICM能够在高放大率下获取复杂的细胞形态，并且不与样品表面发生单次接触，否则会导致细胞变形。如图4（a）中的SICM图像所示，细胞可以将其纤毛伸展到周围细胞以连接并形成复杂的网络结构。该结构的高度变化超过几微米。此测量清楚地展示了SICM即使在液体中复杂的细胞结构上也能获取表面形貌的优势。图5展示了未经处理（图5（a））和经洗涤剂处理（Triton X-100，浓度分别为0.01%、0.1%和1%，分别如图5（b）、（c）和（d）所示）的细胞表面的形貌信息。即使在很小的洗涤剂浓度下，未经处理和经洗涤剂处理的细胞表面之间也存在显著的形貌差异。在未处理的细胞表面上观察到光滑且干净的结构，而经洗涤剂处理的细胞膜则出现孔洞和表面破损。在这项研究中，SICM通过获取高分辨率图像而不损坏细胞表面，为洗涤剂处理后表面结构的变化提供了个性化的见解。SICM是生物应用的有前途工具。

图4. 在液体条件下通过SICM成像的大鼠气管组织纤毛细胞（a）和在真空条件下通过SEM成像的纤毛细胞（b）。图片来源：日本新潟大学Ushiki教授

图5. 通过SICM获得的细胞表面图像：未经处理的细胞（a）；用0.01% Triton X-100处理的细胞（b）；用0.1% Triton X-100处理的细胞（c）和用1% Triton X-100处理的细胞（d）。