探针-样品相互作用的力测量

原子力显微镜常用于成像样品形貌。此外，AFM还常用于测量表面的纳米力学性能。力-距离（FD）光谱是一种直接且可靠的技术，可用于定量研究各种样品的纳米力学性能，如杨氏模量和粘附力。因此，力-距离光谱已成为聚合物科学、生物化学和生物学等多个研究领域的基本表征工具。在力-距离光谱中，悬臂用作力传感器。通过监测单个接触点上悬臂的垂直偏转来测量样品与探针针尖的相互作用，从而测量样品的纳米力学性能。悬臂偏转与Z扫描器移动之间的接近和回缩曲线可以转换为FD曲线，其中包含有关给定位置样品的变形、杨氏模量和粘附力的信息。在进行FD测量时，探针针尖与样品表面之间存在几种相互作用力（表1）。在长达几微米的距离内，主要是静电力构成远程相互作用。在探针针尖与样品距离达几纳米时，范德华吸引力和毛细管力（仅在空气中）占主导地位。一旦探针针尖与样品接触，排斥的相互作用就会在探针针尖与样品之间起主导作用。当探针针尖从样品表面缩回时，由于粘附力，悬臂会向表面弯曲。

图1.（a）FD光谱的示意实验装置。（b）分别为红色和蓝色的接近和回缩曲线。右侧显示的是探针针尖与样品之间不同的相互作用区域以及相应的悬臂偏转，分别用字母A至E标记。

为了测量FD曲线，解耦的Z扫描器控制探针针尖接近和从样品表面缩回，同时保持恒定的XY位置，如图1（a）所示。对于每个位置，将悬臂偏转与Z高度作图，如图（b）所示：在吸引性的探针-样品力占主导地位时，悬臂向样品表面弯曲；在排斥性的探针-样品力占主导地位时，悬臂远离表面弯曲。图1（b）展示了一个示例性的FD光谱测量，包括用字母A至E标记的不同相互作用区域。在A区域，探针针尖远离表面，因此没有可测量的探针-样品相互作用。

表1：在FD光谱测量中，作为距离函数的探针-样品相互作用力。

B区域标志着跳跃接触，这主要是由环境潮湿条件下毛细管力引起的，此时一层薄薄的水覆盖了探针针尖和样品。当吸引力梯度超过悬臂的弹簧常数时，就会发生跳跃接触。随着Z扫描器进一步向样品表面延伸，占主导地位的排斥力继续增加，直到在C区域达到预定的力设定点，此时Z扫描器将探针针尖从样品表面缩回。在D区域的某个力阈值以下，由于吸引性的粘附力，悬臂会向样品表面弯曲。在E区域发生拉脱，当Z扫描器进一步缩回且悬臂的弹簧常数克服探针-样品粘附力时，悬臂从表面分离。

图2.（a）力与高度的接近和回缩曲线，显示了压痕和悬臂偏转的叠加，以及（b）仅考虑压痕贡献的力与分离的接近和回缩曲线。

如何获得定量的纳米力学数据？

通常，悬臂偏转是通过具有四个区域（四象限）的位置敏感光探测器（PSPD）来测量的。上面的两个象限标记为A和C，下面的两个象限标记为B和D。因此，使用上面两个象限的信号总和减去下面两个象限的信号总和来追踪悬臂的垂直偏转：
垂直偏转：（A+C）-（B+D）

为了从悬臂的挠度中获得定量的探头-样品力，需要校准悬臂的弹簧常数。为此，所谓的热调谐和Sader调谐是最常用的方法。在热调谐方法中，悬臂被近似为谐振子，它在响应热噪声时波动。在这里，均分定理将悬臂的布朗运动与其弹簧常数相关联。另一方面，Sader方法通过使用悬臂的自由谐振频率、长度和宽度以及品质因数来计算弹簧常数。作为经验法则，热调谐方法适用于谐振频率小于100 kHz的悬臂，而Sader方法适用于谐振频率大于100 kHz的悬臂。然而，由于测量的探测器信号是样品变形（压痕）和悬臂挠度的组合，因此应将进退曲线转换为FD或力与分离距离曲线，以进行定量的模量测量（图2）。分离距离定义为：
Δ分离 = 高度 - 悬臂偏转

在这里，高度指的是FD测量过程中Z扫描器的位置，而Δ分离是探针针尖相对于样品表面的位置，即真实的探针-样品距离。对于基于探针在样品表面压痕的定量弹性测量，对悬臂偏转的这种校正特别重要。此类测量需要准确分离偏转和压痕，因此需要将高度转换为探针和样品之间的分离。

图3. 从力与分离曲线得出的机械性能：杨氏模量和刚度是根据样品压痕确定的，粘附力和能量是根据回缩曲线计算的，而能量耗散是由接近和回缩之间的滞后给出的。

如图3所示，可以从力与分离曲线中获得样品表面的各种机械性能。样品的刚度可以通过力与分离曲线在接触区域的斜率来确定。为了将刚度（一种外在的样品特性）转换为定量的杨氏模量（一种内在的材料特性），必须考虑探针-样品接触的几何形状。为此，需要应用接触力学模型之一（例如，Hertz、DMT、JKR和Oliver-Pharr模型），这主要取决于探针的几何形状和主导接触力的类型。除了刚度和杨氏模量之外，粘附力可以测量为回缩曲线中的最大负力。粘附能是给定为回缩曲线与基线之间的面积。最后，能量耗散（表示由不可逆过程引起的能量损失）是由接近和回缩之间的滞后（图3中力与分离曲线中的黄色阴影区域）确定的。

力与分离曲线的形状在很大程度上取决于探针、样品以及探针-样品之间的相互作用。图4展示了具有不同特性的材料上的各种力与分离曲线。当比较硬样品和软样品的力与分离曲线的接触区域时，可以清楚地看到，随着样品硬度的增加，曲线的斜率也随之增加。因此，在相同的z高度下，硬样品会使悬臂产生更大的偏转，因为硬样品不像软样品那样容易被压入。此外，与低粘附性样品相比，高粘附性样品需要更大的恢复力来分离探针和样品，这反映在负方向上更大的振幅上，如图4（c）和（d）中的蓝色力与分离曲线所示。根据悬臂和样品的特性，探针可能会导致样品的弹性（可逆）或塑性（不可逆）变形。对于纯弹性变形，接近和回缩曲线的斜率会重叠，如图4（e）所示，并且能量耗散仅限于样品粘附。然而，如果样品被硬悬臂过度压缩，样品表面将发生不可逆变形。随后，接近和回缩曲线的斜率将不同，如图4（f）所示，从而导致能量耗散。

图4. 根据不同的样品特性，力与分离曲线的趋势，包括（a）和（b）弹性，（c）和（d）粘附，以及（e）和（f）能量耗散。

图5.（a）在液体中固定的胚胎干细胞的形貌图像，采用真正非接触模式测量，（b）在该位置随后获得的力与距离曲线。图（b）中的红色线代表接近曲线，蓝色线代表回缩曲线。

力-距离（FD）光谱的应用实例

生物学领域
在生物学样品中，细胞表面的形貌通常通过无创非接触模式进行成像，而其机械特性则通过FD光谱获得。图5展示了固定胚胎干细胞的真正非接触形貌，以及在单次FD测量过程中探针引起的细胞变形。在接近过程中，微绒毛蛋白与探针结合。图5（b）中的回缩曲线（蓝色）在300皮牛（pN）范围内显示出两个明显的粘附力阶跃特征。这些阶跃源于在回缩过程中附着在探针上的微绒毛脱落时，所测得的粘附力的变化。

单分子光谱技术
为了测量如DNA等分子的机械性能，探针和样品都可以进行功能化，如图6（a）所示。为此，所谓的树突分子化学结合到探针和基底上，作为后续寡核苷酸功能化的锚定点。这些探针和表面的寡核苷酸可以通过各自的碱基对形成氢键，实质上形成DNA双链键。如图6（b）所示，FD曲线允许测量这种DNA双链的结合强度，即回缩曲线中的粘附力。在这种情况下，FD光谱在同一位置重复约200次，以获得可靠的解离力统计信息，如图6（c）所示。解离力的平均值约为64皮牛，分布范围狭窄，这表明原子力显微镜（AFM）是研究单个DNA分子与RNA分子、蛋白质或其他单个DNA分子相互作用的有用工具。

聚合物复合材料
此外，FD光谱不仅允许测量单个FD曲线，还可以基于FD曲线映射测量力体积（FV）图像。FV成像提供了材料特性（如刚度、杨氏模量和粘附性）的详细图谱。在这里，为每个像素测量一个完整的力-距离曲线，从而提供纳米机械特性与形貌特征之间的相关性，如图7所示。图7（c）显示了在聚合物/玻璃样品上测量的两条FD曲线的并排比较。与具有较大斜率的较硬玻璃表面相比，具有较软聚合物表面的区域在力-距离曲线的接触区域中展现出较小的较低斜率。此外，聚合物表面的回缩曲线在负方向上表现出更大的力，表明其粘附性更大。为了进行更直观的比较，可以使用力体积测量来生成特定区域的粘附或刚度图像，如图7（d）和（e）所示。

图6. 单分子光谱学示例。（a）50聚体DNA寡核苷酸与DNA功能化树突分子的自组装单层（SAM）的化学附着过程。（b）DNA探针与互补50聚体DNA之间相互作用的典型FD曲线。（c）从200条FD曲线中获得的解离力直方图。

图7. FV成像功能的SmartScan用户界面（a）。嵌入玻璃基底中的聚合物的机械特性测量。形貌（b）、聚合物和玻璃上的FD曲线（c），以及通过刚度（d）和粘附力（e）获得的力体积图像。